乙酰fu酶A含量试剂盒,微板法

乙酰fu酶A含量试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 乙酰辅酶 A（Acetyl-CoA）含量测定试剂盒说明书 （货号：WS6280W 微板法 96 样） 一、产品简介： 乙酰辅酶 A 是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢 纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶 A 汇聚成一条共同的代谢 通路--三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路*底氧化生成二氧化碳和水，释放能 量用以 ATP 的合成。它也是合成脂肪酸、酮体、胆*醇及其衍生物等生理活性物质的 前体物质。 苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和 NAD+生成草酰乙酸和 NADH。柠檬酸合酶可催化乙 酰辅酶 A 和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶 A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反 应，乙酰辅酶 A 含量和 NADH 的生成量成正比，340nm 下吸光值的上升量反应了乙 酰辅酶 A 含量的高低。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 瓶 -20℃保存 部，再加 用前甩几下或离心使试剂落入底 9mL 试剂一溶解备用。 试剂三 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 9mL 试剂一溶解备用。 试剂四 粉体 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、乙酰辅酶 A 含量测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织样本，加 1mL 的提取液，进行冰浴匀浆，粗提液全部转移到 EP 管 中，12000rpm，4℃离心 10min，上清液待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104)：提取液(mL)为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，设定波长至 340nm。 ② 试剂解冻至室温（25℃），在 96 孔板中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 【注】若ΔA 差值较小如小于 0.005，可增加样本取样质量 W，如增至 0.2g 或更多，或增 加样本加样量 V1（如增至 60μL 或更多，则试剂二和三分别减少 20μL 相应减少）， 则改变后的 V1 和 W 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按照样本质量计算： 乙酰辅酶 A 含量(nmol/g 鲜重)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(W×V1÷V)=3215×ΔA÷W 2、按细胞数量计算： 乙酰辅酶 A 含量(nmol/104 cell)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(500×V1÷V)=6.43×ΔA ε---NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，20μL=0.02mL； V2---反应体系总体积，200μL=2×10-4L； W---样品质量，g； 500---细胞数量，万。 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂二 85 试剂三 85 混匀，室温（25℃）下，5min 后于 340nm 处读取 A1 值。 试剂四 10 混匀，室温（25℃）下，反应 10min 后 于 340nm 处读取吸光值 A2，ΔA=A2-A1。