中性木聚糖酶测定试剂盒,微板法

中性木聚糖酶测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 中性木聚糖酶（Neutral Xylanase，NEX）测定试剂盒说明书 （货号：WS0170W 微板法 96 样） 一、产品简介： 木聚糖酶在自然界分布广泛，可从动物、植物和微生物中获得。可将木聚糖降解成低 聚糖和木糖的一组酶的总称，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，广泛应用于酿造和饲料 工业中。 中性木聚糖酶（NEX）在中性环境中水解木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水 浴条件下进一步与 3,5-二硝基水杨中发生显色反应，在 540nm 处有特征吸收峰，反应 液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在 540nm 吸光值增加速 率，可计算 NEX 活力。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 100mL 液体×1 瓶 4℃保存 试剂一 25mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部， 再加 12.5mL 试剂一溶解备用。 试剂三 21mL×1 瓶 -20℃保存 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、中性木聚糖酶（NEX）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： 1 组织样本：称取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 1mL 经预冷的 95%乙 醇冰浴匀浆，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀，向沉淀中 加入经预冷的 80%乙醇混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清， 留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液，涡旋混匀，4℃放置 10min；12000rpm， 4℃离心 10min；留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间 隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(mL)为 500：1 的比例进行提取。 3 液体样本：澄清液体直接检测；若浑浊则 12000rpm，4℃，离心 15min，取上清待测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 540nm。在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 50 50 试剂一 50 50 试剂二 50 40℃孵育60min 试剂二 50 试剂三 100 100本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，沸水浴（95-100℃）5min，冷却至室温 蒸馏水 100 100 混匀，取出200μL待检液至96孔板中，于540nm处读取吸 光值A，ΔA=A测定-A对照（每个测定管设一个对照管）。 【注】1. 若 A 值大于 1.5，最后一步检测时可进行稀释：如取 100μL 待检液至 96 孔板中，再加 100μL 蒸馏水，相当于稀释倍数 D 为 2，需带入计算公式参与计算。 2. 若ΔA 小于 0.01，则可增加样本加样体积 V1（如增至 100μL，则试剂一减少为 0μL）， 则改变后的 V1 代入公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 2.3432x - 0.0246，x 是标准品摩尔质量（μmol），y 是△A。 2、按蛋白浓度计算： 酶活定义：40℃，PH6.0 条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生 1nmol 木糖所需的 酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。 NEX 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(Cpr×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷Cpr×D 3、按鲜重计算： 酶活定义：40℃，PH6.0 条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的 酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。 NEX 活力(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(W×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷W×D 4、按细菌/细胞密度计算： 酶活定义：40℃，PH6.0 条件下，每 1 万个细菌或细胞每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还 原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。 NEX 活力(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷(500×V1÷V)÷T×D =142.3×(ΔA+0.0246)÷500×D 5、按液体体积计算： 酶活定义：40℃，PH6.0 条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 木糖 所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。 NEX 活力(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0246)÷2.3432×103]÷V1÷T×D=142.3×(ΔA+0.0246)×D V--提取液体积，1mL； V1--样本体积，0.05mL； T--反应时间，60min； W--样本质量，g； 木糖分子量--150.131；500--细胞数量，万；D--稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4,0.6,0.8, 1. mg/mL。 3 50μL 标准品+50μL 试剂一+50μL 蒸馏水+100μL 试剂三，混匀，沸水浴（95-100℃） 5min，冷却至室温，再加 100μL 蒸馏水，混匀后取出 200μL 液体至 96 孔板中，于 540nm 处读取吸光值 A。根据结果即可制作标准曲线。