植物果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)试剂盒

植物果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 植物果糖1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA） 试剂盒说明书 （货号：WS3060F 紫外分光法 48 样） 一、产品简介： 植物中的果糖 1,6- 二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 是卡尔文循 环(Calvin)中重要的酶，是控制光合作用速率的重要酶之一。在植物中有两种在结构上有 一定同源性的果糖 1, 6-二磷酸醛缩酶的异构型，即叶绿体型和胞质型。 FBA 可催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，在酶促复合物的相继 作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD 和α-磷酸甘油，检测 340nm 处 NADH 的下 降速率即可得出 FBA 活性的高低。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 50mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液体 50mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体μL×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 2.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×4 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，每支加 0.6mL 蒸馏水溶解，用 不完的试剂分装后-20℃保存，禁止 反复冻融，三天内用完。。 试剂三 液体μL×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 2.2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 4.2mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、天平、震荡仪、低 温离心机、研钵。 四、植物果糖 1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）活性测定： 1、样本制备： ① 总FBA酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液二进行冰浴匀浆，于4℃，13000rpm 离心5min，取上清液测定。 ② 胞浆和叶绿体 FBA 酶的分离： 称取约0.2g样本，加入1mL提取液一，快速冰浴匀浆后于4℃，1600rpm离心5min，弃沉淀， 取上清再4℃，5000rpm离心15min，取上清用于测定胞浆FBA酶活性，取沉淀加1mL提取液 二，强力涡旋震荡15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃，13000rpm离心5min，取上清 测定叶绿体中FBA酶活性。提示：整个叶绿体的提取过程须保持4℃低温环境。 建议测定总 FBA 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBA，则按照步骤②提取粗酶液。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 2、 上机检测： 1 紫外分光光度计预热 30min，调节波长至 340nm，设定温度 25℃，蒸馏水调零。本试剂盒仅供科研使用 2 2 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 1mL 石英比色皿（光径 1cm）中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 50 试剂一 40 试剂二 40 试剂三 40 试剂四 480 试剂五 80 轻轻混匀，室温（25℃）条件下，于 340nm 处测 定，2min 时读取 A1，15min 后读取 A2， ΔA=A1-A2。 【注】1.若△A 值在零附近，可适当延长反应时间 T（如由 15min 增至 25min 后读取 A2），或增 加样本加样体积 V1（如由 50μL 增至 100μL，则试剂四相应减少），则改变后的 T 和 V1 需代入公式重新计算。 2. 若下降趋势不稳定，可以每隔 30S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与 计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 3. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会 偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于检测。 4. 若△A 值大于 0.5，则需减少反应时间（如由 15min 减至 5min 后读取 A2），或减少样 本量（如由 50μL 减至 20μL，则试剂四相应增加），则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按照样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 FBA(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=156.5×ΔA÷Cpr 2、按照样本质量计算： 酶活定义：每克组织每分消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 FBA(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=156.5×ΔA÷W ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光径，1cm； V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.05mL； V2---反应体系总体积，0.73mL=7.3×10-4L； T---反应时间，15 min； W---样本质量，g Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。