二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒微板法

二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 植物二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）试剂盒说明书 （货号：WS2060W 微板法 96 样） 一、产品简介： 核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco，EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键 酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的 大小直接影响着光合速率。初始活性可反映体内酶的活化状态，总活性为体内已活化的酶 加上潜在活化的酶活性。 在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）与 1 分子的 CO2结合，产生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），在 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的共同作用 下，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶 I（NADH）氧化。因此，通过检测 340nm 下 NADH 的下降速率，即可得出 Rubisco 的酶活性大小，为了使 NADH 的氧化和 CO2 的固 定同步。本试剂盒加入了 ATP 再生系统。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×3 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，每 支分别加 0.74mL 蒸馏水溶解备用。用 不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反 复冻融，三天内用完。 试剂二 液体μL×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底部，再 分别加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 粉剂 mg×1 支 4℃保存 试剂四 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 2mL×1 支 -20℃保存 一次性用不完可分装保存于-20℃。 【注】本试剂盒仅提供 96 个样本的初始活性检测或者 96 个样本的总活性检测。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。 四、二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离 心 10min，取上清，置冰上待测。 【注意】 若样本颜色较深（如植物叶片），可引起起始值 A1 值较大如超过 1.5，可在样本制备过程中 增加除色素步骤：取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 1mL 的 80%乙醇冰浴匀浆， 12000rpm，4℃离心 10min，弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到 的沉淀中加入 1mL 提取液，混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，所有试剂解冻至室温（25℃） ② 提示：一般以检测初始活性为主。若检测总活性则该试剂盒从可以检测 96 个样本本试剂盒仅供科研使用 2 减少为 48 个样本。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 初始活性测定管 总活性测定管 样本 10 10 试剂一 20 20 试剂二 10 10 试剂三 10 10 试剂四 130 130 试剂五 20 混匀，25℃孵育 15min 20 轻轻混匀，室温（25℃）条件下，于 340nm 处检测，10s（待反应体 系稳定）时读取 A1，10 min 后读取 A2，ΔA=A1-A2。 【注】 1. 初始活性测定管，加完试剂五后立即按照操作说明书检测；总活性测定管于 25℃孵育 10min 后再加试剂五，再按照操作说明书检测； 2. 若 10s 后反应体系未稳定可延长到 1min 再读值。 3. 若△A 值在零附近，可适当延长反应时间 T（如由 10min 延长到 20min 后读 A2），或增加 样本加样量 V1(由 10μL 增至 30μL），则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 4. 若 A1 值太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高）， 可以适当减少样本加样量 V1(由 10μL 减至 5μL），则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 5. 若ΔA 值大于 0.4，则需减少反应时间 T（如由 10min 减至 5min），则改变后的 T 需代入计 算公式重新计算。 6. 若下降趋势不稳定，可以每隔 20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计 算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T=643.1×ΔA÷Cpr 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内固定 1 nmol CO2定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol CO2/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷2÷T=321.6×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W 单位定义：每克组织在每分钟内固定 1 nmol CO2定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol CO2/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷2÷T=321.6×ΔA÷W 3、按细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷500 V--加入提取液体积，1 mL； V1--加入样本体积，0.01mL； d--96 孔板光径，0.5cm； V2--反应体系总体积，2×10-4 L； ε--NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W--样本质量， g； 2---每固定 1 nmol CO2有 2 nmolNADH 被氧化； T---反应时间，10min； 500--细胞数量，万； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。