乙酰乳酸合成酶（ALS）活性试剂盒

乙酰乳酸合成酶（ALS）活性试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase, ALS）活性测定试剂盒 （货号：WS2440F 分光法 24 样） 一、产品简介： 乙酰乳酸合成酶( ALS，EC 2.2.1.6) 是支链氨基酸生物合成途径中的一个关键酶，此生 物合成过程只存在于植物和微生物体内，是绿色除草剂的重要作用靶标。 乙酰乳酸合成酶( ALS)可催化 2 分子的丙酮酸生成乙酰乳酸，该产物在硫酸作用下脱羧 生成乙酰甲基甲醇，该产物与显色剂反应生成有色物质，该有色物质在 525nm 处有特征 吸收峰，通过检测该有色物质的增加速率即可得出 ALS 酶活性大小。 反应方程式：2 pyruvate =2-acetolactate+CO2。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底 部，再加 1.2mL 蒸馏水混匀 溶解，仍 4℃保存。 试剂二 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 2mL×1 支 4℃保存 试剂四 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、低温离心机、水浴锅、可调式移液 器、研钵、蒸馏水。 四、乙酰乳酸合成酶（ALS）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰 浴匀浆，4℃×12000rpm 离心 15min，取上清液待测。 【注】:若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加 入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重 复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30 min，调节波长为 525nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂于 25℃水浴中预热 10 min。 ③ 在 EP 管中依次加入下列试剂： 试剂名称（μL） 样本管 对照管 试剂一 40本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 260 300 样本 100 100 35℃条件下，暗反应 1h 试剂三 40 40 60℃条件下水浴脱羧 15min 试剂四 200 200 试剂五 200 200 60℃下水浴显色 15min，12000rpm 离心 5min，取澄清 上清液至 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm），于 525nm 处 读值。ΔA=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。 【注】：若ΔA 的值非常低在零附近，可增加样本量 V1（如增至 200μL，则试剂二相应减少） 或延长反应时间 T（如增至 2h 或更长），则重新调整的 V1 和 T 代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0156x + 0.0023，x 是标准品乙酰甲基甲醇摩尔质量（nmol）；y 是△A。 2、按照样本质量计算： 酶活定义：每克组织每小时催化底物产生 1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。 ALS (nmol/h/g 鲜重)=[(△A-0.0023)÷0.0156]÷(W×V1÷V)÷T×D=641×(△A-0.0023)÷W×D 3、按照样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每小时催化底物产生 1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。 ALS (nmol/h/mg prot)=[(△A-0.0023)÷0.0156]÷(Cpr×V1)÷T×D =641×(△A-0.0023)÷Cpr×D 4、按细菌数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每小时催化底物产生 1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。 ALS (nmol/h/104 cell)=[(△A-0.0023)÷0.0156]÷(500×V1÷V)÷T×D=1.28×(ΔA-0.0023)×D W---样品质量，g； V---提取液体积，1 mL； V1---上清液体积（mL），0.1mL； T---反应时间，1h。 D---稀释倍数，未稀释即为 1； 500---细胞数量，万； Cpr---上清液蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水混匀溶解。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL。也 可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据对照管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线，标准品乙酰甲基甲醇的摩 尔质量为 88.11。