芳基酰胺酶活性测定试剂盒,微板法

芳基酰胺酶活性测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 芳基酰胺酶活性测定试剂盒说明书 （货号：WS3340W 微板法 96 样） 一、产品简介： 芳基酰胺酶(aryl-acylamidase) (EC 3. 5. 1.3)，广泛存在于动物、植物、微生物中，可水 解带有酰胺基团的化合物，是生物体内农药及其他外源物质的重要水解酶之一。 本试剂盒采用芳基酰胺酶水解底物产生对硝基苯胺，在波长 405nm 处有最大吸收峰， 通过检测生成的产物对硝基苯胺在 405nm 处的增长速率即可得出该酶活性大小。 二、测试盒组成和配制： 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、离心机、可调式移液器、研钵、乙醇、冰和蒸馏水。 四、芳基酰胺酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂 一，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 15min，取 上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 405nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 为了减少操作误差，建议使用排枪。 ④ 依次在 96 孔板中加入： 【注】1. 加完试剂二即启动反应，所以试剂二加完混匀后立即检测，若 A2 值大于 1.5，可对样本进行稀 释，稀释倍数需代入公式重新计算。 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 125mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 4mL×1 支 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若要重新做标曲则用到该试剂。 试剂名称（μL） 测定管 试剂一 120 样本 40 试剂二 40 混匀，立即于 405nm 处读取 A1 值，37℃反应 30min 后读取 A2 值。ΔA=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用 2 2. 若ΔA小于0.005，可增大样本量V1（如增至80μL，试剂一相应减少），则改变后的V1需代入公 式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0279x - 0.009：x 为标准品(nmoL)，y 为ΔA。 2、按样本鲜重计算： 单位定义：在 37℃，每克组织每分钟催化产生 1nmoL 标准品定义为一个酶活单位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(W×V1÷V)÷T =29.87×(ΔA+0.009)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：在37℃，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmoL标准品定义为一个酶活单位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/mg prot)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(V1×Cpr)÷T=29.87×(ΔA+0.009)÷Cpr 4、按细胞数量计算： 酶活定义：在 37℃，每 104个细胞每分钟催化产生 1nmoL 标准品定义为一个酶活单位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/104 cell)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(500×V1÷V)÷T=0.06×(ΔA+0.009) 5、按照液体体积计算： 单位定义：在 37℃，每毫升液体每分钟催化产生 1nmoL 标准品定义为一个酶活单位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/mL)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷V1÷T=29.87×(ΔA+0.009) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.04mL； T---反应时间，30min； W---样本质量，g； 500---细胞数量； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/mL）：临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入 0.1mL 乙醇，涡旋震荡溶解后再加入 0.9mL 的蒸馏水混匀，得到 10μmol/mL 备用。 2 用蒸馏水把母液稀释成以下浓度：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实际来 调整浓度。 3 40μL 标准品+160μL 试剂一，混匀后于 405nm 处读取 A 值，依据结果即可制作标准 曲线。