天冬酰胺合成酶（ASNS)试剂盒

天冬酰胺合成酶（ASNS)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 天冬酰胺合成酶（Asparagine Synthetase，AS）试剂盒说明书 （货号：WS9340F 分光法 48 样） 一、产品简介： 天冬酰胺合成酶（AS，EC 6.3.5.4) 广泛存在于植物和微生物体内，是一个以氨或谷*酰 胺及天冬氨酸为底物催化合成天冬酰胺的关键酶，该酶对于研究植物营养有重要意义， 天冬酰胺合成酶（AS) 催化谷*酰胺的氨基转移到天冬氨酸形成天冬酰胺，同时生成谷* 酸；利用谷*酸脱氢酶作用于生成的谷*酸，同时使 NAD+还原成 NADH，通过测定 NADH 在 340nm 处的增加速率，进而得出天冬酰胺合成酶活性大小。 该酶催化反应：ATP+L-aspartate+L-glutamine+H2O=AMP+diphosphate+L-asparagine+L-glutamate。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再 加入 6mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉体 mg×1 瓶 -20℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再 加入 6mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再 加入 6mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再 加入 3mL 蒸馏水溶解备用。 试剂五 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂六 液体 8mL×1 瓶 4℃保存 试剂七 粉体 mg×2 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，每 支加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、水浴锅、可调式移液 器、研钵、冰和蒸馏水。 四、天冬酰胺合成酶（AS）活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织（水分多的样本取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 150 150 试剂一 50 50 试剂二 50 50本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 50 50 试剂四 50 试剂五 250 300 混匀，37℃下孵育 20 分钟 95℃沸水浴 3 分钟，上下混匀后，12000rpm 离心 5 分钟， 上清液待测。 ③ 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 ②歩上清液 300 300 试剂五 300 300 试剂六 80 80 试剂七 20 20 混匀，37℃下孵育 20 分钟，全部液体转移至 1mL 石英比色皿 （光径 1cm）中，于 340nm 处读吸光值 A， △A=A 测定-A 对照（每个样本需设一个自身对照）。 【注】若△A 差值在零附近，可在③反应阶段增加上清液（V3）的量（如增加到 400-500μL， 则试剂五相应减少）；或延长第②歩中 37℃反应时间 T（如由 20min 增加至 40min）； 或增加②歩中样本加样体积 V1（如由 150μL 增至 250μL，则试剂五相应减少）；则 改变后的 V3 或 T 或 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmoL 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 AS(nmol NADH/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V4×109]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr) ÷T =75×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟生成 1nmoL 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 AS(nmol NADH /min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V4×109]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T =75×ΔA÷W V---加入提取液体积，1 mL； V1---②步中加入样本体积，0.15mL； V2---②步反应体系总体积，6×10-4 L； V3---③反应阶段中上清液，3×10-4 L； V4---③步反应体系总体积，7×10-4 L； d---光径，1cm； ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/moL/cm； W---样本质量，g； T---反应时间，20min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。