土壤天冬酰胺酶（S-ASNase）试剂盒,微板法

土壤天冬酰胺酶（S-ASNase）试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤天冬酰胺酶(solid-asparaginase,S-ASNase) 测定试剂盒说明书 （货号：WS6430W 微板法 96 样） 一、产品简介： 天冬酰胺酶（ASNase，EC 3.5.1.1）是酰胺酶的一种，催化天冬酰胺水解成天冬氨酸 和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用。 土壤中的天冬酰胺酶（S-ASNase）催化天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，利用氨在强碱 的环境下与次氯酸盐和*酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液颜色稳定。其在 630nm 处有特征吸收峰，通过检测氨增加的速率，即可计算该酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 40mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部， 每瓶再加 11mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂六 A：液体 3.5mL×4 瓶 B：液体μL×1 支 4℃保存 临用前取 30μL 的 B 液进一瓶 A 液中，混匀后作为试剂六使用。 混匀后的试剂六一周内用完。 标准管 液体 mL×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该标曲。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液枪、水浴锅或恒温培养箱、甲苯和蒸馏水。 四、土壤天冬酰胺酶（S-ASNase）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本的制备： 取新鲜土样风干或者 37℃烘箱风干，先粗研磨，过 40 目筛网，备用。 【注】：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻； 2、上机检测： ① 培养：取 EP 管依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 土样（g） 0.1 0.1 甲苯 20 20 振荡混匀，室温放置 15min 试剂一 200 200 试剂二 100 混匀，放入 37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育 2h 试剂三 300 300 试剂二 100 充分混匀，沸水浴（95℃-100℃）10min，室温 12000rpm 离心 10min， 上清液待测。本试剂盒仅供科研使用 2 ② 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 630nm。 ③ 显色反应：在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 上清液 15 15 蒸馏水 45 45 试剂四 60 60 试剂五 30 30 试剂六 60 60 充分混匀，37℃放置 20min 后，于 630nm 处读取吸光值 A， ΔA=A 测定管-A 对照管（每个样本做一个自身对照）。 【注】1. 试剂四和五和六需分开加，不能事先混匀。 2. 若ΔA 的值较小，可以增加 37℃孵育时间 T（如增至 4 小时或更长），或在显色反应阶段增加上 清液的量 V1(如增至 30μL，则蒸馏水体积相应减少)；则改变后的反应时间 T 和上清液体积 V1 需代入计算公式重新计算。 3. 若 A 测定的值大于 1.5，可以减少 37℃孵育时间 T（如减至 1 小时或更短），或在显色反应阶段 减少上清液的量 V1(如减至 5μL，则蒸馏水体积相应增加)；则改变后的反应时间 T 和上清液体 积 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 3.1715x - 0.0164；x 为标准品质量（μg），y 为吸光值ΔA。 2、单位定义：每克土样每小时催化天冬酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 S-ASNase (μg/h/g 土样)=(ΔA+0.0164) ÷3.1715×(V÷V1)÷W÷T =6.52×(ΔA+0.0164) ÷W V---反应体系总体积，0.62mL； V1---显色反应阶段上清液体积，0.015mL； T---反应时间，2h； W---土样质量； 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（20μg/mL 的氨）： 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 4, 8, 12, 16, 20 μg/mL。也可根据实际样本 来调整标准品浓度。 3 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。