丙酮酸脱氢酶(PDH)试剂盒,微板法

丙酮酸脱氢酶(PDH)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书 （货号：WS6380W 微板法 96 样） 一、产品简介： 丙酮酸脱氢酶（PDH，EC 1.2.4.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是 丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，把糖酵解和三羧酸循环连接 起来。 丙酮酸脱氢酶（PDH）催化底物丙酮酸钠生成羟*基-TPP，在电子传递体（PMS） 存在下，使噻唑蓝（MTT）还原生成蓝色产物，通过检测该蓝色产物在 566nm 处的增 加速率，即可得出 PDH 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 100mL×1 瓶 -20℃保存 试剂二 液体 20mL×1 瓶 -20℃保存 试剂三 液体μL×1 支 -20℃保存 试剂四 粉剂 mg×2 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部， 每支加 0.6mL 的蒸馏水溶解。 试剂五 粉剂 mg×4 支 4℃避光保存 用前甩几下使试剂落入底部， 每支加 0.3mL 的蒸馏水溶解。 一天内用完。 试剂六 粉剂 mg×2 支 4℃避光保存 用前甩几下使试剂落入底部， 每支加 0.6mL 的蒸馏水溶解。 一周内用完。 试剂七 液体 16mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、丙酮酸脱氢酶（PDH）活性测定： 1、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）： ① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌/细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀 浆，转移至离心管后于 4℃×700g 离心 10min。 ② 弃沉淀，上清液移至另一离心管中，4℃×12000g 离心 10min。用移液器移除上清液(上 清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的酶活性（此步可选做）)，留下沉淀 （沉淀即为线粒体）。 ③ 在沉淀（线粒体）中加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），液体置于冰上用于丙酮酸脱氢酶活性测定。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取，或按照细 菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 566nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂四 10 试剂五 10 试剂六 10 试剂七 160 混匀，30℃下，10s 时于 566nm 处读取吸光值 A1，20min 后读取吸光值 A2，△A=A2-A1。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活性单位。 PDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=107.2×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活性单位。 PDH 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=21.7×ΔA÷W 3、按细菌或细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活单位。 PDH 活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.044×ΔA ε---还原型 MTT 的摩尔消光系数，1.865×104 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---加入提取液体积，0.202mL； V1---加入样本体积，0.01 mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； T---反应时间，20min； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。