ATP含量试剂盒,微板法

ATP含量试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 ATP 含量（磷钼酸比色法）测定试剂盒说明书 （货号：WS5180W 微板法 96 样） 一、产品简介： 三磷酸腺苷（ATP）是生物体内能量转换最基本的载体,是生物体内最直接的能量来源， 测定 ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。 肌酸激酶催化三磷酸腺苷（ATP）和肌酸生成磷酸肌酸，用磷钼酸比色法进行检测， 经波长扫描产物在 700nm 处有最大吸收峰，进而计算得到 ATP 的含量。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液A 50mL×1瓶 提取液B 10mL×1瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉体落入底部，每支再加入 1.1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂二 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉剂μg×2 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉体落入底部，每支再加入 0.55mL 蒸馏水溶解待用；用不完的试剂分装后 -20℃保存，禁止反复冻融。 试剂四 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 临用甩几下使粉剂落入底部，每瓶再依次加入 2.86mL 水混匀，最后加 1.14mL 浓硫酸（加浓 硫酸时务必小心，逐滴缓慢加入水中，注意防护）。 试剂五 液体 40mL×1 瓶 4℃保存 标准液 粉体 mg×1 支 -20℃保存 用前准确称取 2mg 粉体即 ATP 至一新 EP 管中， 再加 1.7mL 蒸馏水溶解即 2μmoL/mL，再用水稀 释一倍成 1μmoL/mL 标准品，待用(-20℃保存，一 周内用完)。 【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿， 避免磷污染。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、可调式移液枪、研钵和蒸馏水。 四、ATP 含量检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织加入研钵中，加 0.5mL 提取液 A 进行匀浆，转至 EP 管中，于 12000rpm，室温离心 10min，取出 250μL 上清液至一新 EP 管中，再加入适量提取液 B 调 PH 至中性（用 PH 试纸测量，PH 在 6.5-8 之间均可）。再加蒸馏水定容至 0.5mL， 该液体待测备用。 【注】：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清；取500万细菌或细胞至研钵中，加0.5mL 提取液 A 进行匀浆，低温超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔本试剂盒仅供科研使用 2 10s，重复 30 次），于 12000rpm，室温离心 10min，取出 250μL 上清液至一新 EP 管中， 再加入适量提取液 B 调 PH 至中性（用 PH 试纸测量，PH 在 6.5-8 之间均可）。再加蒸 馏水定容至 0.5mL，该液体待测备用。 ③ 液体样本： 澄清样本直接检测，若浑浊则 12000rpm，4℃离心 5min 后取上清液测定。 【注】：也可以按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 700nm。 ② 反应液配制：按照试剂四：试剂五=1：5 的比例混匀。用多少配多少的混合液。 ③ 在 EP 管中依次加入： 试剂名称(μL) 测定管 对照管 标准管 （仅做一次） 空白管 （仅做一次） 样本 20 20 标准液 20 试剂一 20 20 试剂二 50 50 50 50 试剂三 10 10 蒸馏水 30 50 充分混匀，37℃准确水浴 30min 反应液 180 180 180 180 混匀，37℃水浴 20min，液体全部转移至 96 孔板中，在 700nm 下 读取各管吸光值 A（每个测定管需设一个对照管）。 【注】若 A 测定-A 对照的值小于 0.01，可增加取样质量 W（如增至 0.2g）或增加样本加 样量 V1（如由 20μL 增至 50μL，则试剂二相应减少）；标准管仍为 20μL，其他试剂不变； 则改变后的 W 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本鲜重计算： ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷(W×V1÷V) =(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W 2、按细菌/细胞密度计算： ATP 含量(nmol/104 cell)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷(500×V1÷V)×103 =2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白) 3、液体中 ATP 含量计算： ATP 含量(μmol/mL)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷V1 =(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白) C 标准---标准液浓度，1μmol/mL； V---加入提取液体积，1mL； V1---加入反应体系中样本体积，0.02mL； V 标---标准品加样体积，0.02mL； W---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，万。