α-甘露糖苷酶活性检测试剂盒,微板法

α-甘露糖苷酶活性检测试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 α-甘露糖苷酶（α-Mannosidase,α-Man）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS0270W 微板法 48 样） 一、产品简介 ： α-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.24,α-Man）是参与植物体内 N-聚糖加工的关键酶之一。是植 物细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶，在分生组织的生长、果实的成熟软化、种子 的萌发等生理进程中起重要作用。 α-甘露糖苷酶（α-Man）催化对硝基*酚-α-D-吡喃甘露糖苷产生对硝基*酚（PNP）， 该产物在 405nm 处有特征吸收峰，通过测定 405nm 光吸收增加速率，即可计算α-甘露糖 苷酶活性。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再 加 1.1mL 蒸馏水超声溶解备用。 试剂二 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、低温离心机、天平、研钵、冰和蒸馏水。 四、α-甘露糖苷酶（α-Man）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本的制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰 浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~10 比例提取。 ② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞，加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(mL)为 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 405nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 20 试剂二 70 90 迅速混匀，37℃保温 30min 试剂三 100 100 混匀，5min 后立即于 405nm 下读取吸光值 A，ΔA=A本试剂盒仅供科研使用 2 测定-A 对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】：1. 若ΔA 在零附近，可增加样本加样体积 V1（即加样量增加至 40μL，则试剂二相应减 少），或延长保温时间 T（如：由 30min 延长至 60min 或更长），重新调整的 V1 和 T 需代入计算公式重新计算。 2. 若 A 测定值大于 1.5，可对样本上清液用蒸馏水稀释，则稀释倍数 D 代入公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0425x + 0.0039；x 为标准品摩尔质量（nmol），y 为ΔA。 2、按蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0039) ÷0.0425÷(V1×Cpr)÷T×D =78.43×(ΔA-0.0039)÷ Cpr×D 3、按样本质量计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0039) ÷0.0425÷(V1÷V×W)÷T×D =78.43×(ΔA-0.0039)÷W×D 4、按细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.0039) ÷0.0425÷(V1÷V×细胞数量)÷T×D =78.43×(ΔA-0.0039)÷细胞数量×D 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mL)= (ΔA-0.0039) ÷0.0425÷V1÷T×D =78.43×(ΔA-0.0039)×D V---加入提取液体积，1mL； V1---加入反应体系中样本体积，10μL=0.01mL； W---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，500 万； T---反应时间，30min； D---稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 在 96 孔板中依次加入：10μL 标准品+90μL 试剂二+100μL 试剂三，混匀于 405nm 下 读取吸光值，根据结果制作标准曲线。