乙酰酯酶（AE）活性检测试剂盒,微板法

乙酰酯酶（AE）活性检测试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 乙酰酯酶（Acetylesterase，AE）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS8170W 微板法 48 样） 一、产品简介： 乙酰酯酶（EC 3.1.1.6，AE）已被证明是消除饲料细胞壁中阿魏酸等酚酸类木质素的关 键酶。可与其他细胞壁降解酶协同作用共同促进饲料等细胞壁的降解。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×2 支 4℃保存 临用前每支加 0.6mL 无水乙 醇混匀溶解，仍 4℃保存。 试剂三 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、蒸馏水。 四、乙酰酯酶（AE）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰 浴匀浆，4℃×12000rpm 离心 15min，取上清液待测。 【注】:若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：可直接测定，或者适当稀释后测定。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min，调节波长为 405nm。 ② 所有试剂于 25℃水浴中预热 10 min。 ③ 在 EP 管中依次加入下列试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 100 100 试剂一 220 240 试剂二 20 混匀，40℃孵育 30min。 试剂三 60 60 混匀，取 200μL 上清液至 96 孔板中（若有浑浊可 8000rpm 离心 5min 后取上清），于 405nm 读取 A 值， ΔA=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。 【注】：① 若ΔA 的值非常低在零附近，可增加样本量 V1（如增至 150μL，则试剂一相应减少） 或延长反应时间 T（如增至 60min 或更长），则重新调整的 V1 和 T 代入公式重新计算。本试剂盒仅供科研使用 2 ② 若△A 的值超过 1，则需要稀释样本，稀释倍数 D 代入计算公式； 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0249x - 0.0042，x 是 PNP 摩尔质量（nmol）；y 是△A。 2、按照样本质量计算： 酶活定义：每克组织每分钟水解底物产生 1nmol PNP 定义为一个酶活单位。 AE (nmol/min/g 鲜重)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(W×V1÷V)÷T×D=13.4×(△A+0.0042)÷W×D 3、按照样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每分钟水解底物产生 1nmol PNP 定义为一个酶活单位。 AE (nmol/min/mg prot)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(Cpr×V1)÷T×D =13.4×(△A+0.0042)÷Cpr×D 4、按细菌/细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟水解底物产生 1nmol PNP 定义为一个酶活单位。 AE (nmol/min/104 cell)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(500×V1÷V)÷T×D =0.03×(ΔA+0.0042)×D 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟水解底物产生 1nmol PNP 定义为一个酶活单位。 AE(nmol/min/mL)=[(△A+0.0042)÷0.0499]÷V1÷T=13.4×(△A+0.0042) W---样品质量，g； V---提取液体积，1 mL； V1---上清液体积（mL），0.1mL； T---反应时间，30 min。 D---稀释倍数，未稀释即为 1； 500---细胞数量，万； Cpr---上清液蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1.4ml 蒸馏水超声溶解。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2 μmol/ml。也可根 据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据对照管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。