αL阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)试剂盒微板法

αL阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidase, α-Afa)试剂盒说明书 （货号：WS4170W 微板法 48 样） 一、产品简介： α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-Afa，EC 3.2.1.55）是一种能够水解非还原呋喃阿拉伯糖残 基的糖苷酶类，使细胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不断解离，促进果胶 的增溶和降解。由于果实成熟过程中常常伴随着阿拉伯糖的丧失，该酶活性在果实成熟软 化中的研究具有重大意义。 本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法，α-Afa分解对-硝基苯阿拉伯呋喃糖 苷生成对-硝基*酚，后者在405nm有吸收峰，通过测定吸光值升高速率即可得出α-Afa 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 三、所需的仪器和用品 酶标仪、96 孔板、低温台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-Afa）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.2g 组织（水分充足的样本取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰浴匀 浆，然后 12000rpm，4℃，离心 10min，取上清作为粗体液，置于冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ①酶标仪预热 30min 以上，温度设定 37℃，波长设定为 405nm。 ②所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 EP 管中依次加入： 【注】：若ΔA 过小，可以延长保温时间（如：40min 或更长），或增加样本加样量 V1(如增至 20μL， 则提取液相应减少)，则改变后的反应时间 T 和加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使试剂粉体落入底部， 再加 1.5mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂二 液体 18mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 25 蒸馏水 25 提取液 35 35 迅速混匀，37℃保温 30min 试剂二 180 180 混匀，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 处测定吸光 值 A，ΔA=A 测定-A 对照（每个样本需设一个对照管）。本试剂盒仅供科研使用 2 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 0.063x - 0.0015；x 为标准品摩尔质量（nmol），y 为ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚定义为一个酶活性单位。 α-Afa 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0015) ÷0.063]÷(V1×Cpr)÷T =52.9×(ΔA+0.0015) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位的定义：每克组织每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚定义为一个酶活性单位。 α-Afa 活性(nmol/min/g 鲜重)= [(ΔA+0.0015) ÷0.063]÷(W×V1÷V)÷T =52.9×(ΔA+0.0015)÷W V----加入提取液体积，1mL； V1----加入反应体系中样本体积，0.01mL； W----样本质量，g； T----反应时间，30min； PNP 对分子质量----139.11 Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2mg/mL。也可根据 实际样本来调整标准品浓度。 3 在 EP 管加入：10μL 标准品+25μL 蒸馏水+35μL 提取液+180μL 试剂二，混匀，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下读取吸光值。 4 根据结果制作标准曲线。