α-木糖苷酶试剂盒,微板法

α-木糖苷酶试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 α-木糖苷酶（α- xylosidase）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS3170W 微板法 48 样） 一、产品简介 ： α-木糖苷酶(EC 3.2.1.177)是一类木聚糖降解水解酶，存在于植物、细菌和真菌等生物 体，促使非还原末端α-D-木糖残基的水解，释放出α-D-木糖。 α-木糖苷酶催化对硝基*酚-α-D-木糖苷产生对硝基*酚（PNP），该产物在 405nm 处 有特征吸收峰，通过测定 405nm 光吸收增加速率，即可计算α-木糖苷酶活性。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部， 再加 1.4mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 液体 5 mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液 20 mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、低温离心机、天平、研钵、冰和蒸馏水。 四、α-木糖苷酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本的制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰 浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~10 比例提取。 ② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞，加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104 个)：提取液体积(mL)为 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 25 蒸馏水 25 试剂二 45 45 迅速混匀，40℃保温 20min 试剂三 180 180 混匀， 取 200μL 转移到 96 孔板中，405nm 处测定吸光 值 A，ΔA=A 测定-A 对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】：若ΔA 低于 0.01，可增加样本取样量 V1（如增至 30μL，则试剂三相应减少），本试剂盒仅供科研使用 2 或延长保温时间（如：40min 或更长），或增加样本质量 W，则改变后的 V1 和 T 和 W 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0401x+0.0028；x 为标准品摩尔质量（nmol），y 为ΔA。 2、按蛋白浓度计算： 定义：40℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚（PNP）为一个酶活单位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1×Cpr)÷T =124.7×(ΔA-0.0028)÷ Cpr 3、按样本质量计算： 定义：40℃下，每克组织每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚（PNP）为一个酶活单位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1÷V×W)÷T =124.7×(ΔA-0.0028)÷W 4、 按细胞数量计算： 定义：40℃下，每 104个细胞每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚（PNP）为一酶活单位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1÷V×细胞数量)÷T =124.7×(ΔA-0.0028)÷细胞数量 5、按液体体积计算： 定义：40℃下，每毫升液体每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚（PNP）为一个酶活单位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0028) ÷0.0401÷V1÷T=124.7×(ΔA-0.0028) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入反应体系中样本体积，10μL=0.01mL； W---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，500 万； T---反应时间，20min； PNP 对分子质量---139.11。 Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 在 EP 管加入：10μL 标准品+25μL 蒸馏水+45μL 试剂二+180μL 试剂三，混匀，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下读取吸光值。 4 根据结果制作标准曲线。