离子结合型果胶(ISP)含量试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 离子结合型果胶(ISP)含量试剂盒说明书 （货号：WS5070W 微板法 96 样） 一、产品简介： 果胶是构成细胞初生壁和中胶层的主要成分，主要由原果胶、果胶酸甲酯和果胶酸等形 式广泛分布于植物果实、根茎和叶中。果胶间以 Ca2+、Mg2+、氢键、糖苷键、酯键等方 式与其他物质交联，通过特异的提取方式可以提取得到离子结合型果胶（ISP）和共价结 合果胶（CSP）。 本试剂盒用带有螯合剂的酸溶液特异提取离子结合型果胶（ISP），采用硫酸-咔唑比 色法测定果胶含量。果胶水解为半乳糖醛酸，在硫酸溶液中与咔唑进行缩合反应，生成紫 红色物质，经光谱扫描该物质在 530nm 处有吸收峰，颜色深浅与果胶含量成正比，进 而得离子结合型果胶含量。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 A 液体 120 mL×1 瓶 4℃保存 提取液 B 液体 120 mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 1.5mL×1 支 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、可调式移液器、乙醇、浓硫酸、研钵。 四、离子结合型果胶(ISP)含量测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 取 0.1g 组织（烘干且过筛后的粉末组织可取 0.02g），加 1.5mL 的 80%乙醇，研磨匀 浆，85℃水浴 10min，取出流水冷却后，8000rpm，25℃10min，弃上清，留沉淀（尽 量保留沉淀）。 ② 向沉淀中加入 1mL 的 80%乙醇震荡混匀 2min，85℃水浴 10min，取出流水冷却后， 8000rpm，25℃10min，弃上清，留沉淀（尽量保留沉淀）。 ③ 加入 1mL 的提取液 A，90℃水浴 15min（间隔 3min 晃动一次），8000rpm，室温（25℃） 离心 10min，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入 1mL 丙酮振荡混匀，8000rpm，室温 （25℃）离心 10min，弃上清，留沉淀，（注:若色素仍很多，继续用丙酮提取 1-2 次）， 打开 EP 管置于 90℃孵育 20min，使沉淀干燥。 ④ 向沉淀中加入 1mL 提取液 B，室温（25℃）震荡提取 1 小时后，8000rpm，25℃离 心 10min，上清液待测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长为 525nm。 ② 可取两个样本做适当梯度的稀释（如 4 倍，即 1 份上清液+3 份蒸馏水），确定 适合本次实验的稀释倍数 D。 ③ 在 EP 管中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称 （µL） 测定管 空白管 （仅做一次） 样本 70 蒸馏水 70 浓硫酸 420 420 可用封口膜缠紧，85℃水浴 15min 后， 流水冷却至室温。 试剂一 14 14 混匀，室温（25℃）暗处反应 30min（间隔 10min 混匀一次），立即取出 200µL 于 96 孔中，于 530nm 处读取吸光值 A，△A=A 测定-A 空白。 【注】：1、浓硫酸必须是分析纯级别，且不能长期开口放置，否则影响显色结果。另外浓硫酸具有 强腐蚀性，操作时需特别注意，85℃加热取出后冷却再打开盖子，以防液体飞溅烧伤。 2、显色反应必须在暗处反应，否则颜色很快消失或者变淡，影响吸光值。 3、若 A 测定管值大于 1.8，可用蒸馏水稀释样本即待检测上清液，则稀释倍数 D 需代入公 式计算；或若 A 值再零附近可增加样本取样质量 W。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 1.8749x -0.0018，x 为标准品浓度（mg/mL），y 是△A。 2、离子结合型果胶(mg /g 重量)= [(ΔA +0.0018) ÷1.8749×V1]÷ (W×V1÷V)×D =0.53×(ΔA +0.0018)÷W×D W---样本重量，g； V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.07mL； D---稀释倍数。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（0.5mg/mL）：临用前向标准品中加入 2mL 蒸馏水（现配现用）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5. mg/mL。 也可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。

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