果胶裂解酶(PL)试剂盒,微板法

果胶裂解酶(PL)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 果胶裂解酶（pectinate lyases，PL）试剂盒说明书 （货号：WS2070W 微板法 96 样） 一、产品简介： 果胶裂解酶(反式消去酶，EC 4.2.2.10)是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果 胶酶，主要来源于微生物，可提高水果出汁率，并在减少环境污染等方面具有潜在的应 用价值。 果胶裂解酶（PL）作用于果胶中的α-1,4 糖苷键，生成在还原端 C4 和 C5 之间位置具 有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在 235nm 处有特征吸收峰。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板（UV 板）、天平、低温离心机、恒温水浴锅、研钵。 四、果胶裂解酶的测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.2g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间 隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接测定。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 235nm。 ② 试剂一和试剂二预先在 50℃水浴 5min。 ③ 在 EP 管中按照下表依次加入试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 120 试剂二 120 上清液 20 20 混匀，50℃反应 30min 试剂三 60 60 混匀，取 150μL 于 96 孔板（UV 板）测 定 235nm 处吸光值 A，△A=A 测定管-A本试剂盒仅供科研使用 2 对照管（每个样本做一个自身对照）。 【注】1. 若 A 测定管大于 2，可减少上清液取样量 V1（如减至 10μL 则用 10μL 的蒸馏水补齐）， 则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 2. 若△A 在零附近徘徊，可适当增加上清液取样量 V1（如增至 40μL 则试剂三相应减少）， 或延长反应时间 T（如由 30min 延长至 60min），则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按照蛋白浓度计算： 酶活性定义：在 50℃，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的 酶量为一个酶活力单位。 果胶裂解酶（PL）活性(nmol/min/mg prot)=△A÷(ε×d)×109×V2÷(V1×Cpr)÷T =193.2×△A÷Cpr 2、按照样本质量计算： 酶活性定义：在 50℃，每克组织每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶 量为一个酶活力单位。 果胶裂解酶（PL）活性(nmol/min/g 鲜重)=△A÷(ε×d)×109×V2÷(V1÷V×W)÷T =193.2×△A÷W 3、按细菌/细胞密度计算： 单位定义：在 50℃，每 1 万个细菌或细胞每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸 所需的酶量为一个酶活力单位。 果胶裂解酶（PL）活性(nmol/min/104 cell)=△A÷(ε×d)×109×V2÷(V1÷V×500)÷T =0.39×△A 4、按液体体积计算： 酶活性定义：在 50℃，每毫升液体每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的 酶量为一个酶活力单位。 果胶裂解酶（PL）活性(nmol/min/mL)=△A÷(ε×d)×109×V2÷V1÷T=193.2×△A ε---不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：4600L/mol/cm； d---比色皿光径，0.375cm； V2---反应总体积，2×10-4L； V1---反应体系中上清液体积，0.02mL； V---加入提取液体积，1mL； W---样本质量，g； T---反应时间，30min； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr----样本蛋白浓度，mg/mL，建议使用本公式的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。