乙醇酸氧化酶(GO)试剂盒,微板法

乙醇酸氧化酶(GO)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 乙醇酸氧化酶活性测定试剂盒说明书 （货号：WS0160W 微板法 96 样） 一、产品简介： 乙醇酸氧化酶（GO，EC 1.3.3.1）是植物光呼吸过程中的关键酶，它催化乙醇酸氧化生 成乙醛酸，即植物光呼吸的底物。乙醇酸氧化酶与植物光呼吸、生长发育、矿质营养及感 病等密切相关。 乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化成乙醛酸，生成的乙醛酸与苯肼反应生成乙醛酸苯腙。乙 醛酸苯腙 324nm 处有最大吸收峰，通过测定乙醛酸苯腙的增加量，即可得出乙醇酸氧化 酶的酶活大小。 二、测试盒组成和配制： 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板（UV 板）、低温离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、乙醇酸氧化酶(GO)活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心 10min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 324nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 为了减少操作误差，建议使用排枪。 ④ 依次在 96 孔板中加入： 【注】1. 加完试剂二即启动反应，所以试剂二加完混匀后立即检测，若 A2 值大于 1.5，可对样本进行稀 释，稀释倍数需代入公式重新计算。 2. 若ΔA小于0.005，可增大样本量V1（如增至20μL，提取液相应减少），或延长反应时间T（如 增至10min或更长），则改变后的V1和反应时间T需代入公式重新计算。 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 瓶 -20℃保存 临用前甩几下或离心，使粉体落入底 部，再加 2.6mL 蒸馏水混匀备用 试剂二 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下或离心，使液体落入底 部，再加 2.5mL 蒸馏水混匀备用 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 20 提取液 150 试剂二 20 混匀，立即于 324nm 处读取 A1 值，室温（25℃）反应 3min 后读取 A2 值。ΔA=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用 2 五、结果计算： 1、按质量计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化生成 1nmol 的乙醛酸苯腙定义为一个酶活单位。 GO(nmol/g/min)=[ΔA÷(ε×d)×V2×103]÷(V1÷V×W)÷T×D=784.3×ΔA÷W×D 2、按蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化生成 1nmol 的乙醛酸苯腙定义为一个酶活单位。 GO(nmol/mg/min)=[ΔA÷(ε×d)×V2×103]÷(V1×Cpr)÷T×D=784.3×ΔA÷Cpr×D ε---乙醛酸苯腙的摩尔吸光系数为17.0mL/μmol/cm； d---光径距离，0.5cm； V2---反应总体积，0.2mL； V1---样本上样量，0.01mL； V---提取液体积，1mL； W---样本鲜质量，g； T---反应时间，3min； D---稀释倍数，若未稀释则 D 值为 1。