叶绿体3-磷酸甘油醛脱氢酶试剂盒,微板法

叶绿体3-磷酸甘油醛脱氢酶试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 叶绿体 3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADPH-GAPDH)试剂盒说明书 （货号：WS8060W 微板法 96 样） 一、产品简介： 3-磷酸甘油醛脱氢酶分为胞质型和质体型，植物叶绿体中的 3-磷酸甘油醛脱氢酶 （EC 1.2.1.13）属于是质体型，多以 NADPH 为辅酶，催化糖酵解的逆反应，将 1,3 二磷酸甘油酸还原为 3 磷酸甘油醛，该酶在同化 CO2 的卡尔文循环中起中心作用。 利用 GAPDH 逆向催化 1,3 二磷酸甘油酸和 NADPH 生成 3 磷酸甘油醛和 NADP，于 340nm 处测定 NADPH 的下降速率即可得出叶绿体中 NADPH-GAPDH 酶活性的高低。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×3 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，每支加 0.4mL 不完的试剂分装后 蒸馏水溶解，用 -20℃保存，禁止 反复冻融，三天内用完。 试剂三 液体μL×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 液体 16mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、震荡仪、低温离心机、研钵。 四、叶绿体 3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADPH-GAPDH)活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约0.2g样本，加入1mL提取液一，快速冰浴匀浆后于4℃，1600rpm离心5min，弃沉 淀，取上清再4℃，5000rpm离心15min，弃上清留沉淀，向沉淀中加1mL提取液二，强力 涡旋震荡15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃，13000rpm离心5min，取上清测定叶 绿体中3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADPH-GAPDH)的酶活性。提示：整个叶绿体的提取过程须 保持4℃低温环境。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 液体样品：澄清的液体样本直接检测；若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，设定温度 25℃。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 10 试剂四 140 混匀，室温（25℃）条件下，孵育 10min 试剂五 10 轻轻混匀，室温（25℃）条件下，30s 时于 340nm 处读取吸光值 A1，10min 后再读取 A2， ΔA=A1-A2。 【注】1.若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间到 20min 后读取 A2，改变后的反应时间 需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量(如 40μL，则试剂四相应减少)，则改变后 的加样体积需代入计算公式重新计算。 2. 若下降趋势不稳定，可以每隔 20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与 计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 3. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会 偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于 检测； 4. 若ΔA 的值大于 0.5，则需减少反应时间（如减少至 5min），或减少样本量（如 10μL）， 则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按照样本蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GAPDH（nmol/min/mg prot）=[ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=321.6×ΔA÷Cpr 2、按照样本质量计算 酶活定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GAPDH（nmol/min/g 鲜重）= [ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W ×V1÷V) ÷T=321.6×ΔA÷W 3、按照液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADPH-GAPDH(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=321.6×ΔA ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光径，0.5cm； V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.02mL； V2---反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L； T---反应时间，10min； W---样本质量，g Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。