焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸转移酶试剂盒微板法

焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸转移酶试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）试剂盒说明书 （货号：WS7060W 微板法 96 样） 一、产品简介： 焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一种胞质酶，广泛存在于 植物组织中，催化果糖-6-磷酸与果糖-1,6-二磷酸之间的可逆转化，在光合作用碳代谢 中起重要作用。 PFP 催化 6-磷酸果糖转化为 1,6-二磷酸果糖，接着在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作 用下转变为磷酸二羟丙酮，再由 3-磷酸甘油脱氢酶催化，并使 NADH 在 340nm 处的吸 光度下降，由此反映 PFP 酶活性高低。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 支 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，每 支再加 3.1mL 的蒸馏水溶解，用 不完的试剂分装后-20℃保存，禁 止反复冻融，三天内用完。 试剂二 液体μL×1 瓶 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再 加 6.1mL 的蒸馏水溶解 试剂三 液体 2.2mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、可调式移液器、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。 四、焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（PFP）酶活测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 20min， 取上清置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 340nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 依次在 96 孔板中加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 提取液 60 试剂一 60 试剂二 60 试剂三 20 混匀，室温（25℃）条件下，10s 时于 340nm 处读取吸光值 A1，20min 后读取 吸光值 A2，△A=A1-A2。 【注】1.若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间到 30min 或更长读取 A2，改变后的反本试剂盒仅供科研使用 2 应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量，则改变后的加样体积 V1 需代 入计算公式重新计算。 2. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对 会偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液 用于检测； 3. 若ΔA 的值大于 0.5，则需减少反应时间（如减少至 5min），则改变后的反应时间 T 需代入计算公式重新计算。 4. 若下降趋势不稳定，可以每隔 10S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来 参与计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按照样本蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 PFP（nmol/min/mg prot）＝[ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(Cpr×V1÷V) ÷T=160.77×ΔA÷Cpr 2、按照样本质量计算 酶活定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 PFP（nmol/min/g 鲜重）＝[ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W ×V1÷V) ÷T=160.77×ΔA÷W ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； d：比色皿光径，0.5cm； V：加入提取液体积，1mL； V1：加入样本体积，0.02mL； V2：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L； T：反应时间，20 min； W：样本质量，g Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。