植物果糖1,6二磷酸(酯)酶(FBP)试剂盒微板法

植物果糖1,6二磷酸(酯)酶(FBP)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 植物果糖-1,6-二磷酸（酯）酶(Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP) 试剂盒说明书 （货号：WS5060W 微板法 96 样） 一、产品简介： 果糖-1,6 二磷酸酶又称果糖 1,6 二磷酸酯酶（FBP，EC 3.1.3.11），有两种 FBPase 存在于 光合细胞中。胞质型 FBP 主要存在于细胞质，参与蔗糖合成和糖异生途径；叶绿体型 FBP 存在于叶绿体中，它在二氧化碳同化途径中发挥调节作用。 FBP 催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无机磷，接着与酶促复合物相互作用， 伴随着 NADPH 的生成，通过检测 NADPH 在 340nm 处的增加速率，进而计算出 FBP 酶活 性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 2.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵和蒸馏水。 四、果糖-1,6-二磷酸（酯）酶(FBP)活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 总FBP酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液二进行冰浴匀浆，于4℃，13000rpm 离心5min，取上清液测定。 ② 胞浆和叶绿体 FBP 酶的分离： 称取约0.2g样本，加入1mL提取液一，快速冰浴匀浆后于4℃，1600rpm离心5min，弃 沉淀，取上清再4℃，5000rpm离心15min，取上清用于测定胞浆FBP酶活性，取沉淀加1mL 提取液二，强力涡旋震荡15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃，13000rpm离心5min， 取上清测定叶绿体中FBP酶活性。提示：整个叶绿体的提取过程须保持4℃低温环境。 建议测定总 FBP 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBP，则按照步骤②提取粗酶液。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，设置温度 25℃。 ② 试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管本试剂盒仅供科研使用 2 样本 10 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 150 轻轻混匀，室温（25℃）孵育 5min 试剂四 20 混匀，于 340nm 处测定，10s 时读取 A1，10min 后读取 A2，ΔA=A2-A1。 【注】若ΔA 在零附近徘徊，可以延长至 20min 后重新读取 A2，或则增加样本量 V1（如增 至 20μL，则试剂三相应减少），则改变后的反应时间 T 或样本量 V1 需重新代入计 算公司计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。 FBP(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T =643.1×ΔA÷Cpr 2、按照样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 FBP(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109] ÷(W×V1÷V)÷T =643.1×ΔA÷W V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； T---反应时间，10min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。