植物磷酸丙糖异构酶(TPI)试剂盒,微板法

植物磷酸丙糖异构酶(TPI)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 植物磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphate isomerase，TPI）试剂盒说明书 （货号：WS4060W 微板法 96 样） 一、产品简介： 植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶（EC 5.3.1.1, TPI 或 TIM）是光合作用中参与 calvin 循环 的重要酶。磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。 TPI 转化磷酸二羟丙酮转化为甘油醛 3-磷酸，接着与酶混合物作用，伴随着 NADH 的生 成，通过检测 NADH 在 340nm 处的增加速率，进而计算出 TPI 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体μL×1 支 -20℃保存 用前先离心或甩几下使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 试剂二 粉体 mg×1 支 -20℃保存 用前先离心或甩几下使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉体 mg×1 支 -20℃保存 用前先离心或甩几下使试剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、低温离心机、研钵、震荡仪。 四、磷酸丙糖异构酶（TPI）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 总TPI酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液二进行冰浴匀浆，于4℃，13000rpm 离心5min，取上清液测定。 ② 胞浆和叶绿体 TPI 酶的分离： 称取约0.2g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后于4℃，1600rpm离心5min，弃沉淀， 取上清在4℃，5000rpm再次离心15min，取上清用于测定胞浆TPI酶活性，沉淀留用。 取上述沉淀加1mL提取液二，强力涡旋震荡15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃， 13000rpm离心5min，弃沉淀，取上清测定叶绿体中TPI酶活性。 【注】：a、测定总 TPI 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中 的 TPI，则按照步骤②提取粗酶液。 b、整个叶绿体的提取过程须保持4℃低温环境。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，设定温度 25℃。 ② 所有试剂刚从冰箱里面拿出需先解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管本试剂盒仅供科研使用 2 样本 10 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 160 试剂四 10 轻轻混匀，于 340nm 处检测，10s 读取 A1，10min 后读取 A2，△A=A2-A1。 【注】 若△A 在零附近徘徊，可以延长反应时间 T（如 30min），或者加大样本 量 V1（如增至 20μL，则试剂三相应减少），则改变后的反应时间 T 和样 本量 V1 代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按照样本蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 TPI（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷（V1×Cpr）÷T = 643.1×ΔA÷Cpr 2、按照样本质量计算 酶活定义：每克组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 TPI（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷（W ×V1÷V）÷T = 643.1×ΔA÷W V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； T---反应时间，10min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。