6-磷酸山li醇脱氢酶活性试剂盒,微板法

6-磷酸山li醇脱氢酶活性试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 6-磷酸山*醇脱氢酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase）活性试剂盒说明书 （货号：WS5750W 微板法 96 样） 一、产品简介： 6-磷酸山*醇脱氢酶（S6PDH，EC 1.1.1.200）又称醛糖 6-磷酸还原酶（Aldose-6-phos -phate reductase，A6PR），催化 D-山梨糖醇 6-磷酸和 D-葡萄糖 6-磷酸之间的相互转化。研 究发现该酶在苹果叶片等蔷薇科植物中广泛分布，其在山*醇合成中起着重要作用。 6-磷酸山*醇脱氢酶（S6PDH）催化 D-葡萄糖 6-磷酸还原，并使还原型辅酶Ⅱ（NADPH） 氧化。因此，通过检测 340nm 下 NADPH 的下降速率，即可得出 S6PDH 的酶活性大小。 该酶催化的反应：D-sorbitol 6-phosphate+NADP+=D-glucose 6-phosphate+NADPH+H+ 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 支 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 每支分别加 0.6mL 蒸馏水溶解备用。 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止 反复冻融，三天内用完。 试剂二 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。 四、6-磷酸山*醇脱氢酶（S6PDH）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 170 混匀，室温（25℃）下孵育 10min 试剂三 10 混匀，室温（25℃）下，于 340nm 处读取 A1， 10min 后读取 A2。ΔA=A1-A2。 【注】 1.若 10s 后反应体系未稳定可延长到 1min 再读值。 2.若△A 在零附近，可适当延长反应时间 T 至 20min 或更长读取 A2，或适当加大样本量 V1本试剂盒仅供科研使用 2 （如增至 20μL，则试剂二相应减少），则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 4. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏 高），可以适当减少样本加样量 V1，则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于检测； 5. 若ΔA 大于 0.25，需减少反应时间 T（如减至 5min），则改变后的 T 需代入公式重新计算。 6. 若下降趋势不稳定，可以每隔 30S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计 算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 S6PDH 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T =643.1×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算 单位定义：每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 S6PDH 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T =643.1×ΔA÷W V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； T---反应时间，10min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。