糖原合成酶(GCS)试剂盒,微板法

糖原合成酶(GCS)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 糖原合酶（Glycogen synthase，GCS）试剂盒说明书 （货号：WS2650W 微板法 96 样） 一、产品简介： 糖原合酶（GCS，EC 2.4.1.11）将 UDP-G 糖基加到葡萄糖残基上，以α-1，4-糖苷键相 连延长糖链，GCS 是糖原合成的限速酶，对糖代谢和血糖稳态的维持具有重要作用。 GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的逐一作用 下，使NADH氧化为NAD+，通过检测NADH在340nm处的下降量来计算GCS酶活大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再 加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×4 支 -20℃保存 每支用前甩几下使试剂落入底部， 再加 0.3mL 的蒸馏水溶解备用。用 不完的试剂分装后-20℃保存，禁止 反复冻融，三天内用完。 试剂三 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再 加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂四 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再 加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、糖原合酶（GCS）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细胞样本： 先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入 1mL 提取液；超声波破 碎细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm 离心 10min，取上清作为待测样品。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，设置温度 30℃,调节波长至 340nm。 ② 试剂放在 30℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 10 试剂四 140 混匀，30℃下孵育 5min。 试剂五 10 混匀，30℃下，2min 时于 340nm 处读取吸光 值 A1，22min 时读取 A2，△A=A1-A2。 【注】：1.若ΔA 过小，可以延长反应时间（如：32min 或更长）再读取 A2，或增加样本加样量 V1（如 增至 40μL，则试剂四相应减小），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 2.若 A2 值小于 0.45，则需缩短反应时间 T（如减至 12min）再读取 A2 或减少样本量 V1（如减 至 10μL，则试剂四相应增加），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.8×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算 单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCS（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=160.8×ΔA÷W 3、按细胞密度计算 单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCS（nmol/min/104 cell）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.323×ΔA ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； T---反应时间，20 min； W---样本质量，g； 500---细胞数量； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。