海藻糖含量试剂盒(蒽酮比色法)微板法

海藻糖含量试剂盒(蒽酮比色法)微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 海藻糖含量试剂盒（蒽酮比色法）说明书 （货号：WS2550W 微板法 96 样） 一、产品简介： 海藻糖(trehalose)是一种非还原性双糖，广泛存在于动植物、微生物和培养细胞中。具有 在干燥、干旱、冷冻、高渗透压等恶劣环境下保护核酸和蛋白质等生物大分子的作用，被 广泛用于医药、保健品、酶、食品等制品的保存。 本试剂盒用蒽酮-硫酸法测定海藻糖含量，利用糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱 水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在 620 nm 处有最大吸收，其颜色的深浅与糖含量成正比。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×2 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×3 瓶 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，每瓶 加 11mL 的浓硫酸溶解备用。剩余 试剂 4℃保存一周。 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、可调式移液器、研钵、浓硫酸和蒸馏水。 四、海藻糖含量测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织放入研钵中，加入 1mL 提取液进行研磨成匀浆，室温晃动提取 30min， 8000rpm 室温（25℃）离心 10min，取上清。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌或真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或真菌加入 1mL 提取 液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），室温晃动提取 30min， 8000rpm 室温（25℃）离心 10min，取上清。 【注】：若增加样本量，可按照提取液体积(mL) ：细菌或真菌数量(104个)为 1：500~1000 的比例提取。 ③ 液体样本： 取 0.1mL 液体加入 1mL 提取液涡旋混匀，室温晃动提取 30min， 8000rpm 室温（25℃） 离心 10min，取上清。 【注】：若增加样本量，可按照液体体积（mL）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 620nm。 ② 调节水浴锅至 95 度。 ③ 先调2-3个样本做预测定，若吸光值A大于1.5，将样本用提取液稀释后（5-20倍）再 测定，计算公式中乘以相应的稀释倍数D。 ④ 在 EP 管中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 空白管 样本 150 蒸馏水 150 试剂一 300 300 95-100℃沸水浴 3min，冷却后，混匀取 200μL 至 96 孔板 中，于 620nm 处读取吸光值 A，ΔA=A 测定-A 空白。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为：y = 0.0636x + 0.0033；x 为标准品质量（μg），y 为吸光值 A。 2、按样本鲜重计算： 海藻糖含量(μg/g 鲜重)=[(ΔA-0.0033)÷0.0636]÷(W×V1÷V)×D=104.8×(ΔA-0.0033)÷W×D 3、按细菌或真菌密度计算： 海藻糖含量(μg/104cell)=[(ΔA-0.0033)÷0.0636]÷(500×V1÷V)×D=0.21×(ΔA-0.0033)×D 4、液体中海藻糖含量计算： 海藻糖含量(μg/mL)=[(ΔA-0.0033)÷0.0636]÷(V2×V1÷V)×D =1048×(ΔA-0.0033)×D V---提取液总体积 1mL； V1---反应体系中样本体积，150μL=0.15mL； V2---液体体积，0.1mL； W---样本质量，g； D---稀释倍数，未稀释即为 1； 500---细菌或真菌总数，500 万。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 2mL 提取液（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液用提取液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1.mg/mL。 也可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。