结合态淀粉合成酶(GBSS)试剂盒微板法

结合态淀粉合成酶(GBSS)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 结合态淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）试剂盒 （货号：WS8350W 微板法 96 样） 一、产品简介： 结合态淀粉合成酶 GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责 直链淀粉的合成。GBSS 催化 ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生 成 ADP，通过反应体系中添加的酶促混合物依次催化 NADP+还原为 NADPH，且 NADPH 生成量与前一 步反应中 ADP 生成量呈正比。 传统方法是通过检测 340nm 下 NADPH 增加量，但该法检测灵敏度低，且易受到色素（如绿色叶片） 干扰，本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法：该酶促过程产生的 NADPH 与特异的显色探针反 应生成有色物质，通过在 450nm 下检测该有色物质的增加速率，进而计算出 GBSS 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×2 瓶 4℃保存 试剂一 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 6.5 mL×1 瓶 4℃保存 呈分散状态，用前务必摇匀，即可使用。 试剂三 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再加 1.1 mL 的蒸馏水溶解备用。 试剂四 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再加 6.5 mL 的试剂一溶解备用。 试剂五 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再加 17.5 mL 的试剂一溶解备用。 试剂六 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再加 2.2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂七 液体 2.2mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、结合态淀粉合成酶（GBSS）活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织（水分多的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12000rpm，4℃离心 10min，弃上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混匀，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，设定温度 25℃，调节波长至 450nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本（悬浮液） 40 40 试剂一 140 150 试剂二（用前务必摇匀） 30 30 试剂三 10 试剂四 30 30 混匀，30℃反应 20min，沸水浴(95-100℃)2min，12000rpm，本试剂盒仅供科研使用 1 4℃离心 10min，上清液待测。 ③ 显色反应，在 96 孔板中依次加入： 【注】：1.若ΔA 过小，可加大样本量 V1（如：增至 80μL，则试剂一相应减少，反应总体积不变）； 或延长②步中 30℃的反应时间 T（如：延至 30min 或更长）；或增加样本取样质量 W；则 调整后的 V1 和 T 和 W 需代入计算公式重新计算。 2. 若 A 测定大于 1，则可在③步中对上清液用蒸馏水进行稀释，稀释倍数 D 代入公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.1132x + 0.0032，x 是 NADPH 摩尔质量：nmol，y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 GBSS (nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0032)÷0.1132×(V3÷V2)]÷(Cpr×V1) ÷T×D =27.6×(ΔA-0.0032)÷Cpr×D 3、按照样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 GBSS(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0032)÷0.1132×(V3÷V2)]÷(W×V1÷V)÷T×D =27.6×(ΔA-0.0032)÷W×D V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.04mL； V2---上清液体积，100μL； V3---反应体系总体积，250μL； T---反应时间，20min； W---样本质量； D---稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水（母液需在两 天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 10μL 的标准品+180μL 蒸馏水+10μL 试剂七，混匀 10min 后，于 450nm 处读取吸光 值，根据结果即可制作标准曲线。 上清液 100 100 试剂五 80 80 试剂六 10 10 试剂七 10 10 混匀，室温（25℃）孵育 15min，立即于 450nm 处读取吸光 值。△A=A 测定-A 对照（每个样本需做一个样本自身对照）。