甲酸脱氢酶(FDH)活性测定试剂盒,微板法

甲酸脱氢酶(FDH)活性测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH)试剂盒说明书 (货号：WS5440W 微板法 96 样) 一、产品简介： 甲酸脱氢酶(FDH，EC 1. 2. 1. 2)属于 D-2-羟基酸脱氢酶类，广泛应用于辅酶 NADH 的再 生中。 本试剂盒利用甲酸脱氢酶(FDH)催化甲酸和 NAD+不可逆反应生成二氧化碳和 NADH，通 过检测 NADH 在 340nm 的生成速率，进而计算出甲脱氢酶(FDH)活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，每支再加 0.6mL 蒸馏水溶解。 试剂二 粉剂 mg×2 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，每支再加 0.6mL 蒸馏水溶解。 试剂三 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、甲酸脱氢酶(FDH)活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数 量（104个）：建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴， 功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm, 4℃离心 10min，取 上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照数量（104 个）：提取液体积为 500~1000：1 的比例进行提取 ② 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 ② 试剂解冻至室温（25℃）或于 25℃水浴中孵育 10min； ③ 在 96 孔板中按照下表依次加入试剂： 试剂名称（µL） 测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 160 混匀，立即于 340nm 处读取 A1，35℃条件 下孵育 10min 后读取 A2，ΔA＝A2-A1。 【注】：1. 若ΔA 过小如小于 0.01，可增加样本体积 V1（如增至 40μL，则试剂三相应减少）， 或延长反应时间 T（如：30min）或增加样本质量 W（如增加为 0.2g），重新调 整后 V1 和 T 和 W 需代入公式重新计算。 2. 若ΔA 值大于 0.5 且 A2 值大于 1.5，需减少样本体积 V1（如减至 5μL，则试剂 三相应增加），或缩短反应时间 T（如：2min 或更短），重新调整后的样本体积 V1 和反应时间 T 需代入计算公式重新计算。本试剂盒仅供科研使用 2 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。 FDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷(V1×Cpr)÷T=321.5×ΔA÷Cpr 2、按细菌/细胞密度计算： 酶活定义：每一万个细菌/细胞每分钟生成 1 nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。 FDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=321.5×ΔA÷500 3、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体样本每分钟生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。 FDH 酶活(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=321.5×ΔA V1---加入样本体积，0.02mL； V---加入提取液体积，1mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； 500---细菌或细胞总数，万； W---样本质量，g； ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； T---反应时间，10min； Cpr---蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。