支链氨基酸转氨酶(BCAT)测定试剂盒微板法

支链氨基酸转氨酶(BCAT)测定试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 支链氨基酸转氨酶(Branched-chain amino acid aminotransferase，BCAT) 试剂盒说明书 （货号：WS3440W 微板法 48 样） 一、产品简介： 支链氨基酸转氨酶(BCAT, E.C.2.6.1.42) 属于以磷酸吡哆醛作为辅酶的Ⅳ类转氨酶。该酶分布十分广 泛，已经发现广泛存在于原核生物和大多数真核生物中。 支链氨基酸转氨酶(BCAT)催化特异 L-型氨基酸氨基转移到α-酮戊二酸，形成相应的支链α-酮酸和谷*酸； 再用特异作用于谷*酸的酶复合体分解谷*酸，同时与显色剂反应生成黄色物质，该物质在 450nm 处 有最大吸收峰，进而得到支链氨基酸转氨酶(BCAT)的酶活性大小。 该酶催化反应：L-leucine + 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 再加 2.2mL 的蒸馏水充分溶解，仍 4℃保存。 试剂二 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 再加 1.2mL 蒸馏水溶解备用。仍 4℃保存。 试剂三 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。仍 4℃保存。 试剂四 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 2mL×1 支 4℃保存 试剂六 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。仍-20℃保存。 试剂七 液体 1mL×1 支 4℃保存 标准品 液体 mL×1 支 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、支链氨基酸转氨酶(BCAT)酶活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分多的样本取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴 匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】:若增加样本量，可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】:若增加样本量，按照细菌/细胞数量(104个) :提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 20 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 20 试剂三 10 10 试剂四 150 170 样本 100 100 混匀，37℃反应 60min（准确时间），立即于 95℃沸水中水浴 2min 后， 上下振动几下混匀后，12000rpm 室温离心 5 分钟，上清液待测。 ③ 显色反应：在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 提取液 100 100 试剂五 20 20 试剂六 10 10 试剂七 10 10 上清液 60 60 混匀，30℃反应 15min，立即于 450nm 处读取吸光值 A，△A=A 测定-A 对照。（每个样本需设一个自身对照 ） 【注】若△A 差值在零附近徘徊，可以在显色反应阶段增加上清液（V3）的量（如增加到 120μL）， 则提取液相应减少，改变后的 V3 重新代入公式计算；或延长第②歩中 30℃反应时间 T（如由 60min 增加至 90min），则改变后的反应时间 T 需代入计算公式重新计算。。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 0.106x - 0.0032，x 为谷*酸摩尔质量（nmol），y 为△A。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每小时生成 1 nmol 的谷*酸定义为一个酶活力单位。 BCAT (nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(V1×Cpr) ÷T =471.7×(ΔA+0.0032)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每小时生成 1 nmol 的谷*酸定义为一个酶活力单位。 BCAT (nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T =471.7×(ΔA+0.0032)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 单位定义：每百万细菌或细胞每小时生成 1 nmol 的谷*酸定义为一个酶活力单位。 BCAT (nmol/h/104 cell)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(500×V1÷V) ÷T=0.94×(ΔA+0.0032) V---提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.1 mL； V2---反应总体积，0.3mL； V3---显色阶段上清液体积，0.06mL； T---反应时间，60min=1h； W---样本质量，g； 500---细胞数量，百万；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司 BCA 蛋白含量测定试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（10nmol/μL）。 2 把母液稀释成六个梯度：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1. nmol/μL。也可根据实际样本来调整浓度。 3 依据显色反应阶段，测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。