植物铵态氮试剂盒,微板法

植物铵态氮试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 植物铵态氮含量试剂盒说明书 （货号：WS0140W 微板法 96 样） 一、产品简介： 氮素是构成生物体的一种必需元素，自然界中的氮素循环包括许多转化作用。空气中的氮 气被固氮微生物及植物与微生物的共生体固定成氨态氮，经过硝化微生物的作用转化成硝态 氮，后者被植物或微生物同化成有机氮化物，植物组织氨氮含量可反映植物受胁迫的程度。 α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的α-酮酸，酮酸进一步脱羧变 成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应， 缩合生成蓝紫色物质，在 570nm 处有特征吸收峰。 二、测试盒组成和配制： [注]：粉剂量在 mg 级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵、无水乙醇、冰和蒸馏水。 四、植物铵态氮含量的测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行室温匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，上 清液置冰上待测。 [注]:也可按照组织质量（g）提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；12000rpm，4℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。 [注]:若增加样本量，按照细菌/细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min，调节波长到 570 nm。 ② 在 EP 管中按照下表依次加入试剂： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×4 瓶 4℃保存 临用前加入 1.5mL 无水乙醇，盖紧后充分 混匀，再加入 13.5mL 试剂一混匀,10 天内 用完。 试剂三 粉剂×3 支 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底 部，每支再加 1.5 mL 蒸馏水充分溶解，用 不完的试剂分装后-20℃保存(可保存一个 月)，禁止反复冻融，解冻后可 4℃保存并 一周内使用完。 标准品 液体×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 空白管（只做一次） 蒸馏水 40 上清液 40 试剂二 560 560 试剂三 40 40 混匀，盖紧盖（可用封口膜缠绕，防止水分散失）， 置于沸水浴中 15 min，再冷水迅速冷却， 95%乙醇 320 320 混匀，取 200μL 澄清液体（若浑浊可 8000rpm 室温离心 5min）于 96 孔板中，在 570nm 读取吸光值 A，△A=A 测定- A 空白。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.3963x + 0.006；x 是标准品摩尔浓度(μmol/mL)，y 是ΔA。 2、按样本质量计算： 铵态氮含量(μmol/g 鲜重)=[(ΔA-0.006)÷0.3963×V1] ÷(V1÷V×W) =2.52×(ΔA-0.006)÷W 3、按细胞数量计算： 铵态氮含量(μmol/104 cell)=[(ΔA-0.006) ÷0.3963×V1] ÷(V1÷V×500) =2.52×(ΔA-0.006)÷500 4、按照液体体积计算： 铵态氮含量(μmol/mL)=[(ΔA-0.006) ÷0.3963×V1]÷V1=2.52×(ΔA-0.006) V---样品提取液总体积，1mL； V1---加入样本体积，0.04 mL； 500---细胞数量，百万； W---样品质量，g。 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（10μmol/mL）； 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.μmol/mL。也可 根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。