肉桂醇脱氢酶(CAD)试剂盒,微板法

肉桂醇脱氢酶(CAD)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 肉桂醇脱氢酶（ Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)试剂盒说明书 （WS2001W 微板法 96 样） 一、产品简介： 肉桂醇脱氢酶(CAD，EC 1.1.1.195）是作为植物次生代谢特别是木质素合成的关键酶, 与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切。本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方 法：CAD 催化肉桂醇和 NADP+生成肉桂醛和 NADPH，进而与特异的显色剂反应产生有色 物质，通过检测有有色物质的增加速率，进而计算出 CAD 酶活性的大小。 二、试剂盒组分与配制： 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、肉桂醇脱氢酶（CAD）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备 ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、 上机检测 ① 酶标仪预热 30min 以上，温度设定 37℃，调节波长至 450nm。 ② 试剂放在 37℃水浴 5min； ③ 按照下表在 96 孔板中依次加入试剂： 【注】：若ΔA 在零附近徘徊，可延长反应时间 T（如：40min 或更长）， 或加大样本量 V1（如增至 50μL，则试剂三相应减少），重新 调整后的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 5mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体×1 支 4℃保存 试剂三 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前加入 14mL 提取液充分溶解，制备 成反应 mix；用不完的试剂 4℃保存; 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 40 试剂二 10 试剂三 130 混匀，立即 450nm 下读取 A1 值，避光孵育 30min 后读取 A2 值。ΔA=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y=1.5919x-0.0046，x 是 NADPH 摩尔浓度：μmol/mL，y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：在 37℃，每毫克组织蛋白每分钟使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 CAD（nmol/min/mg prot）＝[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷(V1×Cpr) ÷T =20.94×(ΔA+0.0046)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位的定义：在 37℃，每毫克组织蛋白每分钟使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 CAD（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷(W ×V1÷V) ÷T =20.94×(ΔA+0.0046)÷W 4、液体样本中 CAD 活力计算: 单位的定义：在 37℃，每毫克组织蛋白每分钟使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 CAD（nmol/min /mL）＝[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷V1÷T=20.94×(ΔA+0.0046) V：加入提取液体积，1 mL； V1：加入样本体积，0.02 mL； T：反应时间，30 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（0.5μmol /ml）：向标准品 EP 管里面加入 0.6ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5.μmol/ml。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 依据加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。 2