普鲁兰酶活性测定试剂盒,微板法

普鲁兰酶活性测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 普鲁兰酶活性测定试剂盒说明书 （货号：WS8750W 微板法 96 样） 一、产品简介： 普鲁兰酶是一种水解酶，广泛存在于微生物及动物、植物体内，能专一地分解淀粉和 糖原及其衍生物分枝点的α-1.6-葡萄糖昔键。它的这种特性最早被用于淀粉结构的理论 研究，到七十年代,普鲁兰酶的应用已扩展到淀粉糖浆、啤酒和酒精生产等多个淀粉深加 工领域，并逐步从实验室阶段走向工业化规模。 普鲁兰酶催化普鲁兰分解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色 氨基化合物，经光谱扫描在 540nm 有特征光吸收，在一定范围内 540nm 光吸收值与还 原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算普鲁兰酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 瓶 4℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部，再 加入 22mL 试剂一充分溶解备 用；用不完的试剂 4℃保存; 试剂三 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、普鲁兰酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称样本 0.1g（水分充足的样本可取 0.5g）于研钵中，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆后 转入离心管中。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 液体样本：直接测定。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： 1 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 20 20 （95℃煮沸 10min 的酶液） 试剂二 100 100 混匀，50℃孵育 30min 试剂三 100 100 混匀，95℃水浴 10min（用封口膜缠紧，以防止水分散失），流 水冷却至室温。 蒸馏水 500 500 混匀，取出 200μL 至 96 孔板中，于 540nm 处读取吸光值 A， ΔA＝A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。本试剂盒仅供科研使用 2 【注】：1.若 A 测定管的吸光值大于 2，可以用蒸馏水对整个显色混合液用蒸馏水进行稀释（如取 显色混合液 100μL 至 96 孔板中，再加 100μL 蒸馏水，即稀释 2 倍），则稀释倍数 D 需 代入公式计算。或减少上清液体积 V1（如减至 10μL，则加 10μL 蒸馏水补齐），则 V1 需代入公式重新计算。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加样本加样体积 V1（如增至 40μL，则最后蒸馏水体积相 应减少，保持反应总体积不变），或延长 50℃孵育时间 T（如增至 60min），则相应的 V1 和反应时间 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 8.154x - 0.0438；x 为标准品质量（mg），y 为ΔA。 2、按蛋白浓度计算： 单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 普鲁兰酶活性（μg/min /mg prot）=[(ΔA+0.0438)÷8.154×103]÷(V1×Cpr )÷T =204.4×(ΔA+0.0438)÷Cpr 3、按鲜重计算： 单位定义：37℃每克组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 普鲁兰酶活性（μg/min /g 鲜重）=[(ΔA+0.0438)÷8.154×103]÷(W×V1÷V2)÷T =204.4×(ΔA+0.0438)÷W 4、按液体样本计算： 单位定义：37℃每毫升液体样本每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 普鲁兰酶活性（μg/min /mL 液体）=[(ΔA+0.0438)÷8.154×103]÷W×V1÷T =204.4×(ΔA+0.0438) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入反应体系中样本体积，0.02mL； T---反应时间，30min； W---样本鲜重，g； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的蛋白含量(考马斯亮蓝法)试剂盒，不 建议使用蛋白含量(BCA 法) 试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 按照：20μL 标准品+100μL 蒸馏水+100μL 试剂三，95℃水浴 10min，冷却后，再加 500μL 蒸馏水，混匀，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下测定，根据结果即可制作 标准曲线。