β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)试剂盒,微板法

β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 

β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）试剂盒说明书 

（货号：WS6250W 微板法 96 样）

一、产品简介： β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-GA，EC 3.2.1.39)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解， 进而破坏真菌细胞壁，特别是与几丁质酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长。在植物 染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，以增强植物体对不良外界刺 激产生抗性反应，因此β-1,3-GA 活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。 β-1,3-GA 水解昆布多糖的β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端。利用 3,5 二硝基水杨酸测 定还原糖的量，在 540nm 读取吸光值，进而得出β-1,3 葡聚糖酶的活性。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 8mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 用前加入 4.5mL 试剂一，充分溶解 待用；用不完的试剂 4℃保存； 试剂三 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 1mL 经预冷的 95%乙醇冰浴匀浆， 4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀，向沉淀中加入经预冷的 80%乙醇混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀。再向沉 淀中加入 1mL 经预冷提取液，涡旋混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 10min； 留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：也可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取） ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入下列试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 20 煮沸样本* 20 试剂二 20 20本试剂盒仅供科研使用 2 充分混匀，放入 37℃水浴 30 min 试剂三 300 300 混匀，95℃水浴 5min（可用封口膜缠紧，防止水分散失），流水冷却至室温 蒸馏水 560 560 混匀，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 处记录各管吸光值 A， ΔA=A 测定-A 对照（每个样本一个对照管）。 【注】：1.煮沸样本*：将同一个样本在沸水（98-100℃）中煮沸 15 分钟，以将酶彻di灭活， 再 12000rpm，4℃离心 10min；上清液备用。 2.若ΔA 很小在零附近徘徊，可在样本制备时加大取样质量 W（由 0.2g 增加到 0.5g 等），或增加样本加样量 V1（由 20μL 增加到 100μL，相应的蒸馏水减少，保持 总体积 900μL 不变），或延长 37℃水浴时间 T（由 30min 增至 60min），则改变 后的 W 和 V1 和 T 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 4.4558x - 0.0362；x 为标准品质量（mg），y 为ΔA。 2、按蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟分解昆布多糖产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-GA(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0362)÷4.4558×103]÷(V1×Cpr) ÷T=374×(ΔA+0.0362)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟分解昆布多糖产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-GA(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0362)÷4.4558×103]÷(W×V1÷V) ÷T=374×(ΔA+0.0362)÷W 4、按细菌/真菌密度计算： 酶活定义：每1万个细菌或真菌每分钟分解昆布多糖产生1μg葡萄糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-GA(μg/min/104 cell)=[(ΔA+0.0362)÷4.4558×103]÷(500×V1÷V) ÷T=0.75×(ΔA+0.0362) 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升样本每分钟分解昆布多糖产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-GA(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0362)÷4.4558×103]÷V1÷T=374×(ΔA+0.0362) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，20μL =0.02mL；T---30min； W---样本鲜重，g； 500---细菌/真菌总数，500 万； 葡萄糖分子量---180.16； Cpr---样本蛋白质浓，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 2, 4, 6, 8, 10. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表（标准品替换样本，且试剂二换成蒸馏水）操作，根据结果即 可制作标准曲线。