糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒

糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 

糖原磷酸化酶 b（GPb）试剂盒说明书 

（货号：WS5650F 分光法 24 样） 一、产品简介： 糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶， 使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放 1-磷酸葡萄糖，直至临 近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前 4 个葡萄糖基处。GP 分为有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa） 和无活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）两种形式。GPb 在一定浓度的腺苷酸（5， -AMP）存在 下可被激活。 本试剂盒提供一种快速，灵敏和简便的检测方法，GP 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基 生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原 成 NADPH，接着与特异显色剂反应生成有色物质，通过检测该有色物在 450nm 的增加速率， 进而计算出 GP 酶活性大小。添加一定浓度的腺苷酸（5， -AMP）时测定 GP（GPa 和 GPb） 活性，未添加腺苷酸（5， -AMP）时测定 GPa 活性，GP 活性－GPa 活性得到 GPb 活性。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂三 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂四 液体 2mL×1 支 4℃保存 试剂五 液体 32mL×1 瓶 4℃保存 试剂六 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 2.4mL 蒸馏水充分溶解备用。 标准品 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液 器、研钵、冰。 四、糖原磷酸化酶 b（GPb）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细胞样本： 先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入 1mL 提取液；超声波破 碎细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm 离心 10min，取上清作为待测样品。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。本试剂盒仅供科研使用 2 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，设置温度 30℃,调节波长至 450nm，蒸馏水调零。 ② 试剂放在 30℃水浴 5min； ③ 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 40 试剂二 20 20 试剂三 20 20 试剂四 40 40 试剂五 600 640 混匀，30℃条件下孵育 10min 试剂六 40 40 混匀，30℃条件下，2min 时立即于 450nm 处读取吸光值 A，△A=A 测定-A 对照（每个样本需做一个样本自身对照）。 【注】：1. 若ΔA 过小，可以延长反应时间 T（如：10min 或更长）再读取 A2，或增加样本量 V1（如增 至 80μL，则试剂五相应减小），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 2. 若 A 测定值大于 1.5，可缩减反应时间 T（如：1min 或更短）再读取 A2，或减少样本量 V1（如 减至 20μL，则试剂五相应增加），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0317x-0.0095，x 是标准品摩尔质量：nmol，y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔA+0.0095) ÷0.0317]÷ (V1×Cpr) ÷T=394.3×(ΔA+0.0095)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 GPb（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔA+0.0095) ÷0.0317]÷(W×V1÷V) ÷T=394.3×(ΔA+0.0095)÷W 4、按细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 为一个酶活力单位。 GPb（nmol/min/104 cell)= [(ΔA+0.0095) ÷0.0317]÷(500×V1÷V)÷T=0.79×(ΔA+0.0095) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01 mL； W---样本质量，g； T---反应时间，2 min； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水（母液需在两 天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 nmol/μL。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 依据加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。