海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)试剂盒

海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用

海藻糖-6 磷酸合成酶（TPS）试剂盒说明书 （货号：WS6550F 分光法 24 样） 一、产品简介： 海藻糖-6磷酸合成酶（TPS，EC 2.4.1.15）是海藻糖合成的关键酶之一，催化UDP- 葡萄糖和葡萄糖-6磷酸生成海藻糖-6磷酸和UDP。UDP与磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激 酶和乳酸脱氢酶的逐一作用下，使NADH氧化为NAD+，通过检测NADH在340nm处的 下降量来计算TPS的酶活力大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 再加 0.9mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 液体 32mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 再加 2.2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 粉剂 mg×4 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 分别加 0.55mL 蒸馏水溶解备用。用 不完的试剂分装后-20℃保存，禁止 反复冻融，三天内用完。 试剂五 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱/金 属浴、可调式移液器、研钵、冰。 四、海藻糖-6磷酸合成酶（TPS）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌或真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或真菌加入 1mL 提取 液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），室温晃动提取 30min， 8000rpm 室温（25℃）离心 10min，取上清。 【注】：若增加样本量，可按照提取液体积(mL) ：细菌或真菌数量（104个）为 1：500~1000 的比例提取 2、上机检测： 1 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2 所有试剂解冻至室温（25℃）。 3 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 60 60本试剂盒仅供科研使用 2 试剂一 30 试剂二 210 240 混匀，35℃孵育 30min 后，立即于 95-100℃煮沸 5min， 10000rpm，4℃离心 5min，上清液待测。 4 在 1mL 石英比色皿中依次加入： 试剂二 400 400 试剂三 40 40 试剂四 40 40 试剂五 20 20 ③的上清液 200 200 混匀，35℃下立即于 340nm 处读取各管吸光值 A1， 30min 后读取 A2。△A=(A1-A2)测定-(A1-A2)对照。 【注】 1.若△A 的值在零附近，可以适当延长③歩的反应时间到 60min 后或更长，改变后的反 应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量（如 100μL，则试剂二相应减少）， 则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 2. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的样本）或ΔA 的值大于 0.4，可以适当减少 ③的上清液加样量 V3（如减少至 100μL，则试剂二相应增加），则改变后的加样体 积 V2 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 TPS 活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V4÷（ε×d）×109] ×(V2÷V3) ÷(V1÷Cpr) ÷T =93.8×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算 单位定义：每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 TPS 活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V4÷（ε×d）×109] ×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T =93.8×ΔA÷W 3、按细菌或真菌数量计算： TPS 活力(μg/104cell)= [ΔA×V4÷（ε×d）×109]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V) ÷T =0.188×ΔA V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.06mL； V2---第③歩的反应总体积，0.3mL； V3---第④歩中所取上清液体积，0.2mL； V4---反应体系总体积，7×10-4 L； d---光径，1cm； ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； 500---细菌或真菌总数，500 万； T---反应时间，30min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。